臭氧去除食品加工設備中的熒光假單胞菌生物膜的研究

食品加工環境和設備內生物膜的形成增加了產品變質和病原體污染的風險。就地清洗(CIP)操作在去除土壤和消毒處理設備(包括消除生物膜)方面非常有用。然而，CIP是一個資源密集型的過程，特別是在化學洗滌劑，熱和消毒劑的使用方面。本研究旨在探討將臭氧整合到CIP操作中的可行性，以促進假單胞菌生物膜的消除，其長期目標是減少對傳統清潔和消毒試劑的依賴。為了研究臭氧與CIP的結合，在一個中試食品加工設備上，在10%脫脂牛奶(脫脂牛奶-水混合物，1:9 v/v)中培養2天，在靜止條件下培養出熒光假單胞菌，然后在添加10%新鮮脫脂牛奶的情況下再循環5天。CIP采用22-25℃水洗，50℃0.2%氫氧化鉀堿性清洗，很后用水沖洗。這些CIP操作將浮游細胞數量減少到低于檢測方法的極限，但并沒有從加工設備的光滑或粗糙表面完全去除熒光假單胞菌生物膜。當CIP過程之后應用含水臭氧步驟(10 ppm, 10分鐘)時，處理減少了光滑和粗糙表面的生物膜細胞數量，低于回收方法的檢測限(分別為0.9和1.4 log CFU/ 100 cm2)。這些結果證明了臭氧輔助CIP在去除加工設備上的微生物生物膜方面的效用，但需要進一步研究以優化清洗劑的使用和臭氧的應用。

1. 介紹

在食品加工環境中，對致病菌(如假單胞菌和單核增生李斯特菌)的控制一直是一個難點。在適當的水分和營養條件下，這些細菌可以在食品加工設備上快速形成生物膜(Brooks and Flint, 2008)。由此產生的生物膜是食品重復污染的持續來源，這在很大程度上影響了產品的保質期和安全性。事實上，生物膜在食品行業，特別是乳制品行業中的作用已經得到了廣泛的研究(Panebianco等人，2022)，研究人員發現，細菌可以在乳制品加工操作的幾個環節和加工設備的許多部分形成生物膜(Marchand等人，2012)。變質微生物如假單胞菌的生物膜被認為是乳品加工操作中的一個具有挑戰性的問題。假單胞菌屬的成員無處不在，經常從乳制品生產設備或乳制品中分離出來。假單胞菌產生耐熱脂肪酶和蛋白酶，這些酶在牛奶熱處理后會持續存在，從而通過產生不良風味和氣味導致很終產品變質(Zhang等人，2019)(Reichler等人，2021)。幾種假單胞菌通常從乳制品工廠分離出來;其中包括熒光假單胞菌、fragi假單胞菌、惡臭假單胞菌、嗜蟲假單胞菌和銅綠假單胞菌(Chiesa et al.， 2014)。

就地清洗(CIP)操作旨在通過盡量減少加工過程中的產品再污染來確保加工食品的安全(Seiberling, 1997)。CIP系統去除設備內部表面沉積的材料，無需打開或拆卸設備，很少或根本不需要人工操作(Smithers, 2022)。傳統的CIP操作在去除食品接觸面上形成的生物膜的效果上各不相同(Dufour等，2004)。這種操作通常由以下步驟組成:(1)用水沖洗;(2)堿清洗，或不加酸洗;(3)衛生處理。消毒步驟的設計是為了保持設備足夠的衛生條件。這一步驟通常涉及使用殺菌劑，包括氯、過氧乙酸、碘劑或季銨化合物(Joseph et al.， 2001)。然而，處于生物膜狀態的細菌可以對這些殺菌劑的抗菌作用產生保護作用(Srey et al.， 2013;Wassenaar et al.， 2015)。大量使用這些殺菌劑可能會對人類健康產生負面影響，并導致加工設備惡化(Marino et al.， 2018)。作為一種替代消毒劑，臭氧在食品工業中已被廣泛應用，并被批準用于食品處理、儲存和加工(食品和藥物管理局，2001年)。臭氧的特點是對許多致病性和腐敗微生物具有很強的抗菌活性，并因其對環境的影響很小而被認為是一種環保消毒劑(Pascual等人，2007;Marino et al.， 2018;Masotti等人，2019;Bigi et al.， 2021)。臭氧通過多種機制破壞微生物的細胞質膜和其他細胞成分，包括氧化不飽和脂質、蛋白質和核酸，從而使微生物失活(Khadre et al.， 2001)。臭氧還可以阻止微生物細胞與表面的初始附著，并通過破壞參與細胞的細胞外基質來抑制生物膜的形成(Panebianco et al.， 2022)。

假單胞菌在加工環境中形成生物膜是食品工業中一個相當大的問題，它可能導致產品變質和疾病爆發(Srey等人，2013)。關于假單胞菌生物膜在工業環境下的生成和臭氧對這種生物膜的使用的系統研究是缺乏的。因此，本研究的目的是:(1)研究當脫脂牛奶(乳制品的一個例子)作為營養來源時，熒光桿菌在中試規模的食品加工設備上形成堅固的生物膜的能力;(2)評估在CIP凈化過程中使用臭氧作為消毒劑的生物膜控制技術的效果。

2. 材料與方法

2.1. 臭氧輔助就地清洗系統

臭氧輔助CIP系統(圖1)是俄亥俄州立大學的研究人員和一家臭氧設備制造商(Del ozone, San Luis Obispo, CA)合作為本研究定制的。該系統(圖1)由一個132升的容器(用于存放漂洗水)，三個57升的容器(用于存放堿性溶液，酸性溶液和消毒劑)，一個熱交換器(型號:STFT-6000-240;TruHeat, Richmond Hill, ON, Canada)，一個泵，以及測量湍流，溫度，pH值和電導率的儀表。離心泵(Gould離心泵，型號NPE 1ST1F5B6, Seneca Falls, NY)用于將CIP流體循環到中試規模的食品加工設備，并由GS AC Drive (Automation Direct, Cumming, GA)調節。監測和數據采集使用兩個流量計(Blue-White Industries F-1000, Huntington Beach, CA)，兩個熱電偶(Omega, Stamford, CT)，一個pH計(Jenco Instr。(Emerson/Rosemount Analytical Model 1056 Dual Input Analyzer, Shakopee, MN)，兩個電導率探頭(Emerson)。這些探頭被放置在CIP系統的入口和返回線中，與加工設備相關。CIP設備的設置方式是，通過打開適當的閥門，CIP泵可以從任何單個容器(水，堿性，酸性或消毒劑)中抽出流體，并通過噴霧球將流體引導到加工設備;然后，水流將流經所有的加工生產線，并將水返回到啟動水箱，或者簡單地通過加熱器將水再循環并返回到水箱以控制溫度。臭氧衛生系統(Del ozone AGW 4045)具有內置臭氧發生器和控制器(Del ozone Genesis CD-45GV)，與CIP系統集成在一起?；宓某粞醪糠钟凶约旱难h回路，帶有第二個泵(型號:NPE 1ST1F1B4，古爾德泵)，在使用過程中不斷產生和維持臭氧化水。臭氧系統的設置使CIP泵可以從主臭氧水罐中抽取水。

圖1.代表與臭氧發生器集成并結合中試規模食品加工設備的中試規模原位清洗系統。

2.2. 中試食品加工設備

CIP系統連接到模擬食品加工設備的中試裝置上，該設備由304級不銹鋼制成(圖2)。加工設備的構造便于在清洗過程中連接到CIP系統。加工設備包括:(a) 190-L的罐(容器)，(b)放置在較大管道內的填料閥，(c)管三通，(d)旁通管線，(e)四個小管段(內徑2.54 cm，長5.08 cm，內表面積40.5 cm2)，使用粗砂碳化硅球筒磨具(Brush Research manufacturing, CA)人工制造表面粗糙的管段，(f)四個90°彎頭(內徑2.54 cm，內表面積117.0 cm2)，表面光滑，(g)回流泵(古爾德泵)，型號NPE 1ST1C5E6)，和(h) 7.6米(25英尺)的2.54厘米直徑管。

圖2.實驗裝置的表示，包括用于污染中試規模加工設備和在不銹鋼表面上開發乳品生物膜的結垢系統。污垢設備由以下部分組成，如圖所示：（1）19-L高密度聚乙烯容器，（2）帶4.8毫米穿孔的內部過濾器，（3）在線路上的三個外部過濾器，網孔尺寸為20，40和40，（4）循環蠕動泵，（5）進料管路蠕動泵，（6）5-L進料瓶， （7）插入氯丁橡膠管的小不銹鋼管。加工設備的組成包括：不銹鋼T型管（8），旁通閥（9），填料（10），旁通管（11），四個粗糙表面管段（12）和四個光滑表面90°彎頭（13）。

2.3. 污染系統

所需的實驗生物膜需要是堅固的，并模擬當食品加工設備的清潔被忽視或效率低下時自然會發生的情況。為了使研究易于管理和實驗可重復，生物膜在7天的過程中生成。為了生成這種生物膜，研究人員開發了一種污染系統，該系統由一個19-L高密度聚乙烯容器組成，該容器可容納7.6 L接種的生長培養基，然后在系統中緩慢循環。該設備有一個四步過濾系統，可以在流體流到達泵之前將較大的顆粒從流體流中去除。第一個過濾器作為吸力過濾器放置在容器內(4.8 mm穿孔;麥克馬斯特-卡爾，哥倫布市，俄亥俄州)。其他三種過濾器(濾網尺寸分別為20、40、40;麥克馬斯特-卡爾)是外部的容器，設計用于在污染運行過程中拆卸和清潔，而無需拆卸整個系統或排水。通過過濾器后，流體進入蠕動泵(Masterflex型號:7553-70;Masterflex頭型號:7015;Barrington, IL)，它被指定為“循環泵”，通過目標處理設備部件傳輸污染流體(圖2)。第二個5-L儲液器包含滅菌介質，連接到第二個蠕動泵(Masterflex型號:7521-50;機頭型號:7016;Masterflex)被綁在污染系統的輸入線上，慢慢地添加新鮮培養基，以保持生物體在多天的孵化中生長。污垢系統包含多個小的不銹鋼管(每根內徑為6.35 mm，長9.05 mm，內表面積為3.78 cm2)插入壬二烯管(06402-15;科爾·帕默，弗農山莊，伊利諾伊州);這些試管用于檢測熒光假單胞菌污染期間生物膜形成的穩健性。

2.4. 熒光假單胞菌培養物的制備

熒光假單胞菌ATCC 25289來自俄亥俄州立大學(Columbus, OH)微生物系的培養標本。將細菌的冷凍培養基傳代于胰酶豆湯(TSB;Becton Dickinson & Co.， Sparks, MD)，并在搖床培養箱(New Brunswick Scientific Co. Edison, NJ)中輕度攪拌，在30°C下孵育48小時。將熒光假單胞菌培養物鋪在胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)上;Becton Dickinson & Co.)，在環境溫度(22-25°C)下孵育48小時，然后在TSB中傳代，然后用于實驗(Meyer和Abdallah, 1978)。

2.5. 熒光假單胞菌生物膜發育

為了誘導生物膜的形成，在7.6 l容量的污染系統中進行如下操作。脫脂牛奶(Kroger Co.， Cincinnati, OH)， 760 mL，用蒸餾水稀釋至總積7.6 L，然后在121°C高壓滅菌30分鐘;這將被稱為“生物膜培養基”。生物膜培養基冷卻至室溫(22-25℃)后，接種38 mL (0.5% v/v) P. fluorescens ATCC 25289培養物。接種的生物膜培養基在循環中循環30 min，停滯2 d，然后以1.5 ~ 2.0 L/h的速度恢復循環5 d。接種后的培養基在主污染回路循環的同時，在5-L瓶中填充新鮮的生物膜培養基，用第二蠕動泵以125 mL/h的速度泵送內容物，為熒光假單胞菌繼續生長添加新的營養物質(圖2)。

在生物膜發育過程中，生物膜樣品(即污染回路不銹鋼管)在以下時間點取出:循環開始前(即2天停滯孵化后)和循環5天期間每天取出。每個生物膜樣品由2管組成，一管用于熒光假單胞菌計數，另一管用于掃描電鏡檢查。

2.6. 使用臭氧輔助CIP去除食品加工設備中的熒光假單胞菌生物膜

在進行實驗之前，用洗滌劑溶液清洗所有加工設備的元件并漂洗。除產品罐外，這些元件在121°C下高壓滅菌30分鐘。在實施CIP之前，為了在設備上形成生物膜，在罐和出口管道之間添加污染液，并允許流過填料、旁路、5.08厘米的小管段和彎頭，然后返回污染回路。初步試驗表明，該加工槽易于清洗，因此，該加工槽出口管道是研究的主要對象。因此，受污染的部件為t形管(8)、旁通閥(9)、填料(10)、旁通管線(11)、4個表面粗糙的小管段(12)和4個表面光滑的90°彎頭(13)。接種后的生物膜培養基先在循環中循環30分鐘，停滯2天，然后恢復循環5天，如上所述。在形成堅固的熒光假單胞菌生物膜后，CIP工藝按以下步驟依次實施:(1)預漂洗，(2)漂洗后的堿性清洗，(3)臭氧消毒。管段(圖2，組件12)和彎頭(圖2，組件13)是用來評估CIP步驟去除熒光假單胞菌生物膜有效性的部分。每個CIP步驟后，去除一個節段和肘部，替換新鮮無菌部分，并擦拭其內表面以評估生物膜去除情況。

2.6.1. 除去

一旦生物膜形成過程完成，被污染的處理設備連接到CIP系統，隨后去除污染系統。采用過濾35 μm的自來水，在22-25℃溫度下進行預升。沖洗水由水箱經CIP進口泵以56.7 L/min的速度單次輸送，保證湍流流動;流體的流速為1.87 m/s。沖洗時間確定為1 min，以確保去除所有乳土。

2.6.2. 堿性的清潔

用水預漂洗后，將過濾35 μm的自來水與堿性洗滌劑(CIP 100;Steris, Mentor, OH)，達到0.2%的濃度。通過在線加熱器循環，將溶液加熱至50°C。溫度由溫度控制器(歐姆龍E5C2, Allied Electronics & Automation, Worthington, OH)管理。待溫度穩定后，向加工設備內充入堿性溶液，以56.7 L/min的速度循環2 min。清洗過程中控制溫度(50±2℃)和流速(1.87 m/s)。

2.6.3. Post-rinse

后沖洗消除了被清洗系統中的堿痕跡，并冷卻了系統，使其為臭氧消毒做好準備。經過35 μm過濾的自來水從用于水預沖洗的水箱中取出。將漂洗水引入系統，并測定了溶液在進出口線的電導率。當水電導率達到所需值(22-25℃下300-320 μsc)時，再繼續沖洗1分鐘，直至沖洗完畢并關閉水泵。水流穩定在56.7 L/min。

2.6.4. 臭氧衛生處理

在環境溫度(22-25°C)下使用臭氧水溶液作為消毒劑?？諝庾鳛槌粞醢l生器的入口氣體，因為它有一個集成的氧氣濃縮系統。用電暈放電法將濃氧轉化為臭氧，并借助文丘里裝置與水混合。將臭氧水溶液儲存在臭氧-水箱中(圖1)，通過離心泵(古爾茲泵型號:NPE 1ST1F1B4)在文丘里腔內循環，直至達到所需濃度。過量的臭氧由熱催化臭氧破壞裝置(Del ozone)去除。在該研究中測試了5 ppm或10 ppm的含水臭氧。低濃度(5ppm)應用5min, 10ppm的臭氧溶液測試10min。溶液中臭氧濃度由臭氧監測儀(Q450;ATI，學院維爾，賓夕法尼亞州)在進口和出口線。此外，通過分光光度計(Spectronic 1201, Milton Roy Co.， Houston, TX)在258 nm (A258)處測量紫外吸收，采用紫外光譜法確定了水溶液中臭氧的濃度。

2.6.5. 臭氧輔助CIP系統的抗菌膜效果

改進的CIP系統對未附著的(浮游)和附著的(生物膜)熒光假單胞菌細胞群的有效性進行了評估。浮游細胞的樣本從CIP回路回路上的隔膜取樣口采集(圖1)。這些樣本在清洗過程開始前，在預漂洗、后漂洗堿性清洗和臭氧消毒后，使用10cc注射器(Becton, Dickinson & Co.)采集。在0.1%蛋白胨水中進行連續稀釋，并使用灌注鍍技術將1ml等分液與熔融TSA (Becton Dickinson & Co.)混合(Yousef et al.， 2022)。30℃孵育48 h，計數菌落。第二種類型的采樣是為了推斷清潔過程對生物膜細胞的有效性。生物膜樣品取自粗糙和光滑表面;這些分別是不銹鋼節段(圖2，組件12)和彎頭(圖2，組件13)。為了評估CIP對熒光假單胞菌生物膜種群的影響，在整個清洗過程開始前，在預漂洗、后漂洗堿性清洗和臭氧消毒后，分別去除一段和一個肘部。將切除的切片替換為無菌切片，并恢復清洗過程。

2.7. 生物膜的枚舉

為了確定污染裝置形成的生物膜，在5天的生物膜介質循環中，每天從污染回路(圖2，組件7)中取出兩根小不銹鋼管，以監測強健生物膜的發展。將每個不銹鋼管無菌放入含有25 mL 0.1%蛋白胨水的50 mL螺旋蓋小瓶中。手動搖瓶，然后用另外10ml 0.1%蛋白胨水沖洗試管，以去除未附著的細胞。用兩根無菌棉簽拭除管內表面的生物膜細胞，將棉簽尖端斷開，放入含有9ml 0.1%蛋白胨水的玻璃管中。管，包括拭子，在旋渦混合器(Fisher Scientific Industries, Inc.， Bohemia, NY)中混合約30秒。將得到的懸浮液用0.1%蛋白胨水稀釋，用倒鍍法將其鍍在TSA上，并在30°C下孵育2天(Yousef et al.， 2022)。每管平均CFU換算為CFU/ cm2。

為了在臭氧輔助CIP過程中對熒光p.h ncens生物膜進行計數，用三根無菌棉簽(Fisher Scientific)擦拭不銹鋼節段和肘部的內表面，將生物膜細胞從棉簽的尖端分離到含有25 mL 0.1%蛋白胨水的管中。包括拭子在內的試管在旋渦混合器中混合約30秒。將得到的懸浮液用0.1%蛋白胨水稀釋后，用倒鍍法鍍在TSA上，在30℃下孵育2天。每節平均CFU數換算為CFU/100 cm2。

2.8. 掃描電子顯微鏡對生物膜的檢查

為了用掃描電鏡檢查小不銹鋼管內的生物膜，需要一些準備;這些準備工作按照之前的描述進行(Speers等人，1984;Latorre et al.， 2010)，并做了一些修改。從污染系統中取出的試管，用10ml 0.1%蛋白胨水沖洗，然后放入玻璃小瓶中。用2.5%戊二醛固定于0.1 M磷酸緩沖液中，pH為7.4的葡萄糖溶液中。試管在0.1 M磷酸鹽緩沖液中沖洗3次，每次15分鐘，然后將每個試管小心地縱向切成兩半。半管片在0.1 M磷酸鹽緩沖液中沖洗三次，每次沖洗15分鐘。將洗滌后的含生物膜的半管分別在增加濃度的乙醇(25、50、70、85和95%)中脫水10分鐘，然后在100%乙醇中脫水3次，每次30分鐘。將干燥的樣品安裝在鋁樁上，并在濺射涂層機(Cressington, Redding, CA)中用金涂層2分鐘。對樣品進行掃描電鏡成像(Nova 400 NanoSEM, FEI, Hillsboro, OR)。

2.9. 統計分析

實驗至少重復進行，并獨立重復兩次。數據用兩個獨立重復的平均值±SD表示，使用統計軟件(GraphPad Prism 9.0.0;GraphPad軟件公司，圣地亞哥，加州)。采用方差分析(ANOVA)，采用Tukey兩兩比較，確定治療組之間或治療對比較的顯著性差異。p≤0.05認為差異有統計學意義。

3.結論

在中試規模的食品加工設備上開發堅固的生物膜具有挑戰性;然而，克服這一限制使我們能夠驗證臭氧輔助CIP是消除熒光假單胞菌生物膜的有效方法。本研究提供的證據表明，標準的就地清洗制度使熒光假單胞菌浮游細胞低于計數法的檢出限;然而，完全消除生物膜細胞是不可能的。在清潔過程中加入臭氧作為消毒劑，可以完全去除加工設備粗糙或光滑表面上的生物膜細胞。目前的研究表明，臭氧輔助CIP可以成為食品加工商凈化加工設備的有效方法，特別是在乳制品行業。